匹配分辨率

将CCD相机与显微镜结合使用的研究人员希望在其系统允许的最大空间分辨率下工作。为了做到这一点，必须使显微镜的放大倍数与CCD适当匹配。

此过程的第一步是确定显微镜的分辨能力。任何光学系统的空间分辨率的极限都是通过光衍射来确定的。达到这一水平的光学系统称为“衍射受限”。在这种情况下，空间分辨率由下式给出：

d = 0.61 xlambda / NA

其中d是最小可分辨距离，lambda是被成像光的波长，NA是显微镜物镜的数值孔径。这是通过假设衍射图样中当一个点瑞利盘中心与第二个点的第一个黑环重叠时（瑞利标准），可以将两个点源区分为两个点。

还应该注意的是，对于显微镜系统，此公式中使用的NA是物镜数值孔径和聚光镜数值孔径的平均值。因此，如果聚光器明显不足以使物镜充满光，有时会这样做以提高图像对比度，那么就会牺牲空间分辨率。光学系统中的任何像差，或对性能产生不利影响的其他因素，都只会使空间分辨率降低。但是，大多数显微镜系统的确达到或非常接近衍射极限。

上面的公式表示物镜空间中的空间分辨率。在相机上，分辨率是最小可分辨距离乘以显微镜光学系统的放大倍数。该值必须与CCD匹配。

匹配分辨率最明显的方法似乎是将衍射极限分辨率简单地设置为单个像素的大小。实际上，成像系统真正需要的是它能够区分相邻特征。如果将光学分辨率设置为等于单个像素大小，则可能会将强度相似的两个相邻特征分别成像到CCD上的相邻像素上。在这种情况下，将无法将它们识别为两个单独的特征。

分离相邻特征需要至少一个中间像素的强度值不同。因此，可以通过将光学系统的衍射极限分辨率与每个线性维度上的CCD上的两个像素匹配来实现最佳的空间分辨率。这称为奈奎斯特极限。用数学表达这一点，我们得到：

（0.61 x λ/ NA）x放大倍率= 2.0 x（像素大小）

让我们使用此结果来完成一些实际示例。

示例1：给定相机使用Kodak KAF1401E CCD（像素尺寸6.8μm），可见光（λ= 0.5μm）和1.3 NA显微镜物镜，我们可以计算出可以产生最大空间分辨率的放大倍率。

M =（2 x 6.8）/（0.61 x 0.5 /1.3）= 58

因此，一个60倍，1.3 NA的显微镜物镜可为KAF1401E CCD相机提供衍射极限图像，而无需任何其他放大倍数。但是请记住，这是假设聚光镜系统工作在NA值为1.3。高NA意味着聚光镜和物镜都必须在油浸模式下运行。

示例2：给定相机使用e2v CCD37（像素尺寸15.0μm），可见光（λ= 0.5μm）和100x显微镜物镜且NA为1.3的，我们可以计算出可以产生最大空间分辨率的放大倍率。

M =（2 x 15.0）/（0.61 x 0.5 /1.3）= 128

由于显微镜物镜的设计工作在100倍，因此我们需要使用大约1.25倍的附加投影光学镜才能提供最佳的放大倍率。

应当记住，随着放大倍数的增加和空间分辨率的提高，视野也会减小。同时需要良好空间分辨率和大视野的应用将需要更多像素的CCD。还应注意，增大放大倍率会降低CCD上的图像亮度。这会延长曝光时间，并可能限制需要实时观测得应用。