显微数字成像的基本概念
在整个20世纪的大部分时间里，涂在胶片上的光敏化学乳剂用于从光学显微镜复制图像。 仅仅在过去的十年中，电子相机和计算机技术的进步才使数字成像比传统摄影更快，更便宜，更准确地使用。 随后开发了一系列新颖而令人兴奋的技术，使研究人员能够更深入地探查组织，观察活细胞中极其快速的生物学过程，并获得接近单分子水平的有关时空事件的定量信息。
成像设备是光学显微镜中最关键的组件之一，因为它确定可以在什么水平上检测到精细的标本细节，解析相关的结构和/或可视化并记录过程动态。 目前各种光检测方法和显微镜师当前可用的各种成像设备使设备的选择过程变得困难且常常令人困惑。 本文旨在帮助理解光检测的基础知识，数字图像的基本属性以及与针对特定应用选择合适的检测设备有关的标准。
历史的视角
用显微镜记录图像可追溯到使用显微镜最早的日子。荷兰科学家安东尼·范·列文虎克（Antonivan Leeuwenhoek）和简·斯旺默丹（JanSwammerdam）在1600年代后期开发的第一台单镜头仪器，它被开创性的研究人员用来绘制非常详细的血液，微生物和其他微小标本的图纸。英国科学家罗伯特·胡克（RobertHooke）设计了最早的复合显微镜，并用它写了“显微照相”，这是他在1665年出版的显微学和影像学著作。在此期间开发的显微镜无法投射图像，并且观察仅限于通过目镜近距离观察标本。1835年，威廉·亨利·福克斯·塔尔伯特（WilliamHenry Fox Talbot）应用化学乳化工艺在低倍率下拍摄显微照片时，才首次使用显微镜获得了真实的摄影图像。在1830年至1840年之间，照相乳剂用于记录显微图像的应用呈爆炸性增长。在接下来的150年中，随着照相技术的发展，通过照相乳剂在显微镜下捕获图像的技术和科学也不断发展。在1800年代末和1900年代初，卡尔·蔡司（Carl Zeiss）和恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）完善了专用光学玻璃的制造，并将新技术应用于包括复合显微镜在内的许多光学仪器。
法国博士生让·科曼登（JeanComandon）于1909年引入了生物活体的动态成像技术，他展示了梅毒产生螺旋体的最早延时视频之一。 科曼登的技术使电影制作进入微观世界。 在1970年至1980年之间，研究人员将基于电子管的摄像机与显微镜结合使用，生成延时图像序列和实时视频。 在1990年代，电视摄像管被固态技术和面阵电荷耦合器件（CCD）所取代，开创了显微摄影的新纪元。 当前的用显微镜捕获电子图像的术语是数字或电子成像。
数字图像采集：模数转换
不管聚焦在样本上的光最终会影响到人类的视网膜，胶片乳剂，磷光屏还是CCD的光电二极管阵列，都会产生模拟图像。这些图像可以包含各种强度和颜色。这种类型的图像称为连续色调，因为各种色调的渐变和色相融合在一起而不会中断，产生了原始样本的受衍射限制的还原。连续色调图像通过使用一系列在整个图像中连续变化的电信号波动来准确记录图像数据。
当我们查看它们时，图像的尺寸通常是正方形或矩形，因此每个像素都由具有特定x和y值的坐标对表示，并以典型的笛卡尔坐标系排列（图1c）。 x坐标指定像素的水平位置或列位置，而y坐标指定行号或垂直位置。因此，数字图像由代表由（x，y）坐标系统排序的一系列强度值的矩形或正方形像素阵列组成。实际上，图像仅作为数据值的大型串行数组存在，可以由计算机解释以生成原始场景的数字表示形式。
数字图像的水平尺寸与垂直尺寸之比称为纵横比，可以通过将图像宽度除以高度来计算。长宽比定义图像的几何形状。通过遵守用于显示数字图像的标准纵横比，可以避免在远程平台上显示图像时图像的严重失真。当对连续色调图像进行采样和量化时，所得数字图像的像素尺寸将获得原始模拟图像的纵横比。重要的是，每个像素必须具有1：1的纵横比（正方形像素），以确保与常见的数字图像处理算法兼容并最大程度地减少失真。
数字图像中的空间分辨率SpatialResolution in Digital Images
数字图像的质量或图像分辨率取决于像素总数和每个像素可用的亮度值范围。图像分辨率是数字图像表示显微镜记录的模拟图像的精细细节程度的度量。术语空间分辨率用来描述在构建和渲染数字图像中使用的像素数量。此数量取决于在数字化过程中对图像的采样程度，而更高的空间分辨率图像在相同的物理图像尺寸内具有更多的像素。因此，随着在数字图像的采样和量化期间获取的像素数量增加，图像的空间分辨率也增加。
通过匹配成像设备和用于可视化图像的计算机系统的分辨率，可以确定最佳采样频率或用于构建数字图像的像素数。 应该通过采样和量化生成足够数量的像素，以可靠地表示原始图像。 当模拟图像采样不充分时，大量细节可能会丢失或模糊，如图2中的图表所示。图2（a）中显示的模拟信号显示了采样前原始图像显示的连续强度分布。 和数字化（根据样品位置绘制）。 当获取32个数字样本时（图2（b）），所得图像将保留原始模拟图像中存在的大多数特征强度和空间频率。
如图2（c）和（d）所示，当采样频率降低时，原始图像中存在的频率会在模数（A / D）转换过程中丢失，从而会出现一种被称为混叠的现象。图2（d）展示了采样数量最少的数字图像，其中混叠产生了高空间频率数据的损失，同时引入了实际上并不存在的虚假低频数据。
数字图像的空间分辨率与模拟图像的空间密度以及显微镜或其他成像设备的光学分辨率有关。数字图像中的像素数量和像素之间的距离（采样间隔）是数字化设备精度的函数。光学分辨率是光学镜头系统（显微镜和相机）分辨原始场景中细节的能力的度量。光学分辨率受光学器件，图像传感器和辅助电子设备的质量影响。空间密度和光学分辨率决定了图像的空间分辨率。当成像系统的光学分辨率优于空间密度时，图像的空间分辨率仅受空间密度限制。
数字图像中包含的所有细节均由亮度转换组成，该亮度转换在各种明暗级别之间循环。亮度转换之间的循环速率称为图像的空间频率，较高的速率对应于较高的空间频率。通过显微镜观察到的微小样品中亮度水平变化很常见，背景通常由均匀的强度组成，而样品表现出较大范围的亮度水平。
数字图像中每个像素的数值表示在采样间隔内平均的光学图像的强度。因此，背景强度将由相对均匀的像素混合组成，而样本通常包含的像素值范围从非常暗到非常亮。在显微镜中看到的小于数字采样间隔的特征将无法在数字图像中准确表示。奈奎斯特准（TheNyquist Criterion）则要求采样间隔等于样本最高空间频率的两倍，以准确地保持所得数字图像中的空间分辨率。如果以低于奈奎斯特标准所要求的间隔进行采样，则在最终的数字图像中将无法准确表示具有高空间频率的细节。光学图像的阿贝Abbe分辨率极限约为0.22微米（使用可见光），这意味着数字化仪必须能够以样品空间中0.11微米或更小的间隔进行采样。为了符合奈奎斯特标准，以每条水平扫描线512像素对样本进行采样的数字化仪必须产生56微米（512x 0.11微米）的最大水平视场。建议为最小的可分辨特征设置2.5到3个样本的间隔，以确保为高分辨率成像提供足够的采样。
当以小于其空间频率两倍的速率对模拟图像或实际样本中存在的细节进行采样时，就会发生称为空间混叠（欠采样）的严重采样伪像。当数字化仪中的像素与图像中出现的高频细节相比间隔太远时，最高频率信息会伪装成数字图像中实际上不存在的低空间频率特征。当采样频率下降到低于奈奎斯特分辨率极限约25％的临界水平时，混叠通常会突然过渡。包含规则间隔的重复图案的标本经常会出现莫尔条纹（MoiréFringes），这是由于以低于重复图案频率1.5倍的采样率所引起的混叠伪影所致。
对比度传递函数TheContrast Transfer Function
对比度可以理解为相对于平均图像强度（I）的图像信号强度（ΔI）变化的度量，如以下等式所示：
C = ΔI/I
首先要考虑的是，一个被成像的物体在记录强度上必须与其背景的强度不同才能被感知。对比度和空间分辨率密切相关，并且两者都是在样本中产生代表性的细节图像所必需的。对比度传递函数（CTF）与调制传递函数（MTF）类似，它是显微镜以特定分辨率在中间图像平面中再现样本对比度的能力的度量。 MTF是电气工程中使用的函数，用于将输出信号中存在的调制量与信号频率相关联。在光学数字成像系统中，对比度和空间频率是MTF中输出调制和信号频率的相关性。 CTF通过绘制百分比对比度与空间频率的函数关系来表征光学系统的信息传输能力，如图3所示，图3显示了CTF和物镜在后焦平面处的分布。图3（a）所示的物镜后孔径显示了变化的波长的衍射，该波长从孔径的中心朝向外围周期性增加移动，而图3（b）中的CTF表示光学分辨率的瑞利极限（The Rayleigh Limit）。
空间频率Spatialfrequency 可以定义为周期性特征在给定单位空间或间隔中重复出现的次数。在CTF中以零空间频率记录的强度是图像平均亮度的量化。由于对比度受衍射限制，因此接近零的空间频率将具有较高的对比度（大约100％），而频率接近衍射极限的空间频率将在图像中记录较低的对比度。如图3中的CTF图所示，瑞利准则不是固定的极限，而是对比度降低到约25％的空间频率。因此，CTF可以提供有关成像系统在样本中代表小特征的性能的信息。
可以为成像系统的任何功能组件确定CTF，并且CTF是整个成像系统的性能指标。每个组件确定的CTF曲线的乘积可以用来评估系统性能。因此，它将低于任何单个组件的性能。当图像通过系统的连续组件时，对比度有限的小特征将变得更加不可见。通常在物镜和CCD中观察到最低的CTF。 CCD产生的模拟信号可以在传递给数字化仪之前进行修改，以便使用模拟增益和偏移控制来增加对比度。对图像进行数字编码后，放大倍率的变化和像素几何形状的相应调整可导致整体CTF的提高。.
图像亮度和位深ImageBrightness and Bit Depth
数字图像的亮度是在用数字相机采集图像或通过A/ D转换器数字化图像后，测量整个像素阵列上相对强度值的量度。亮度不应与辐射强度混淆，辐射强度是指实际从被成像对象反射或透射的光能的大小或数量。关于数字图像处理，最好将亮度描述为组成数字图像的所有像素在被捕获，数字化和显示后测得的强度。像素亮度对数字图像处理很重要，因为除颜色外，像素亮度是处理技术可以用来定量调整图像的唯一变量。
无论采用哪种捕获方法，都必须将图像数字化以将样本的连续色调强度转换为数字亮度值。数字值的精度与数字化设备的位深成正比。如果使用两位，则图像只能由四个亮度值或等级（22）表示。同样，如果处理了三个或四个位，则对应的图像将具有八个（23）和16（24）个亮度级别，如图4所示，它说明了位深与数字图像中灰度级数量之间的相关性。如果使用两位，则图像只能由四个亮度值或等级表示。同样，如果处理三位或四位，则相应的图像分别具有八个和16个亮度级别。在所有这些情况下，级别0表示黑色，而顶层表示白色，每个中间级别是不同的灰色阴影。
数字图像的灰度或亮度范围由黑色，白色和灰色亮度级别组成。位深度越大，可用于表示图像强度变化的灰度等级就越多。例如，当一个12位数字转换器连接到动态范围为72分贝（dB）的传感器时，能够显示4,096灰度级（212）。当以这种方式应用时，动态范围是指相对于CCD传感器可以传递用于图像显示的噪声的最大信号电平。可以根据像素信号容量和传感器噪声特性进行定义。类似的术语用于描述在创建和显示数字图像时使用的灰度范围。此用法与场景内动态范围有关。
术语位深是指模数转换器用来将模拟图像信息转换为能够由计算机读取和分析的离散数字值的可能灰度值的二进制范围。例如，最流行的8位数字转换器具有256（28）个二进制可能值，而16位转换器具有65,536（216）个可能的值。A / D转换器的位深决定了灰度级增量的大小，更高的位深度对应于可从相机获得的更大范围的有用图像信息。
为了获得可接受的视觉质量而必须生成的灰度级数量应足以使人眼无法识别各个灰度值之间的步阶。在理想的观看条件下，普通人眼能察觉到的灰度图像强度差异约为2％。人眼最多只能在视频监视器的强度范围内分辨出约50个离散的灰度，这表明图像的最小位深度应在6到7位之间。
数字图像应至少具有8位至10位分辨率，以避免在图像处理过程中提高对比度时在增强图像中产生视觉上明显的灰度级差。 充分描述图像所必需的像素数量和灰度级取决于样品的物理性质。 低对比度，高分辨率的图像通常需要大量的灰度级和像素才能产生令人满意的结果，而其他高对比度和低分辨率的图像（例如线光栅）可以用明显较低的像素密度和灰度级范围来充分表示 。 最后，在对比度，分辨率，位深和图像处理算法的速度之间需要在计算机性能之间进行权衡。
图像直方图ImageHistograms
灰度或图像直方图提供了有关数字图像强度或亮度的各种有用信息。在典型的直方图中，对8位图像的每个灰度级量化像素。水平轴从0缩放到255，代表每个灰度级的像素数绘制在垂直轴上。直方图数据的统计操作可根据对比度和强度比较图像。每个灰度级的像素的相对数量可用于指示数字图像对灰度级范围的利用程度。像素强度在具有正常对比度的图像中的灰度级之间很好地分布，并指示较大的场景内动态范围。在低对比度图像中，只有一小部分可用灰度级被表示，并且场景内动态范围受到限制。当像素强度分布在高灰度级和低灰度级之间时，中间级不被填充，因此黑色和白色像素过多，对比度通常很高。
电荷耦合器件CCD相机的基本特性
用CCD相机创建图像所涉及的基本过程包括：将光电二极管阵列元件暴露于入射光，将累积的光子转换为电子，将所形成的电荷组织到势阱中以及最后通过寄存器将电荷移位到输出放大器。从移位寄存器输出的电荷在A / D转换器中被数字化之前被转换为电压并被放大。光电二极管和光电容器的不同结构布置导致各种CCD架构。一些更常用的配置包括帧转移（FT），全帧（FF）和行间（IL）类型。对基本体系结构的修改（例如电子倍增，背面变薄/照明和使用微透镜（透镜）阵列）有助于提高CCD相机的灵敏度和量子效率。 CCD阵列中的单个金属氧化物半导体（MOS）元件的基本结构如图5所示。衬底是p / n型硅晶圆与晶圆表面涂的一层很薄的二氧化硅（约100纳米）绝缘。导电的，光学透明的，多晶硅正方形或栅极的网格图案用于控制光电子通过阵列元件收集和转移。
在曝光间隔内在CCD中累积后，当向电极施加正电压（0-10伏）时，光电子累积。施加的电压导致在电极下方形成空洞耗尽区域，称为电位阱。在其电荷超过施加的电场之前可以在势阱中积累的电子数称为满阱容量。满阱容量取决于像素大小。荧光显微镜中使用的CCD的典型满阱容量为20,000至40,000光子。过度暴露于光线下会导致像素饱和，其中光子会溢出到相邻像素中，并导致图像拖影Smear或光晕Bloom。在许多现代CCD中，都加入了特殊的“防光晕”通道，以防止多余的电子影响周围的像素。防光晕的好处通常胜过满阱容量的下降，这是该功能的副作用。
电子被允许在势阱中积累的时间长度是由计算机程序控制的指定积分时间。当在栅极上施加电压时，电子被吸引到电极并移动到氧化物/硅界面，在此处电子会聚集在10nm厚的区域中，直到电极上的电压循环或计时为止。施加到栅极的不同偏置电压控制在特定栅下方是否会形成势阱或势垒。在电荷转移过程中，势阱中保持的电荷包以循环或计时过程从一个像素转移到另一个像素，该过程通常类似于图6所示的救火队列解释。在救火队列类比中，首先以并行方式收集雨滴并存储到桶阵列（图6（a）），然后并行转移到串行输出寄存器（图6（b））。累积在串行寄存器中的水一次输出一个桶到输出节点（已校准的测量容器）。根据CCD类型，可以使用各种时钟电路配置。科学相机通常使用三相时钟方案。
电极网格形成二维并行寄存器。 当编程改变电压序列施加到栅极时，电子可以在并行阵列上移动。 并行寄存器中的每一行依次移入串行寄存器。 串行寄存器的内容一次移入一个像素到输出放大器，在输出放大器中产生与每个电荷包成比例的信号。 当串行寄存器被清空时，并行寄存器中的下一行将被移位，并且该过程将继续直到并行寄存器被清空。 CCD的这一功能称为电荷转移或读出，它依赖于电荷从光电二极管到输出放大器的有效转移。 图像数据的传输速率取决于输出放大器的带宽和A / D转换器的速度。
电荷耦合器件相机使用多种架构来完成收集光子并将电荷移出寄存器并移至读出放大器的任务。最简单的CCD架构称为全帧（FF）（请参见图7a）。此配置包括一个并行光电二极管移位寄存器和一个串行移位寄存器。全帧CCD使用整个像素阵列在曝光期间同时检测入射光子，因此具有100％的填充因子。并行寄存器中的每一行都移入串行寄存器。串行寄存器中的像素以离散数据包的形式读出，直到阵列中的所有信息都已转移到读出放大器中为止。然后，输出放大器产生与阵列中每个像素成比例的信号。由于并行阵列既用于检测光子又用于转移电子数据，因此必须使用机械快门或同步的闪灯来防止光电二极管的持续照明。全帧CCD通常可产生高分辨率，高密度图像，但可能会受到明显的读出噪声的影响。
帧转移（FT）架构（图7b）将阵列划分为光敏区域和遮光或掩蔽的阵列，在此处存储电子数据并将其转移到串行寄存器。从活动区域到存储阵列的转移取决于阵列的大小，但可能需要不到半毫秒的时间。在活动图像区域中捕获的数据被快速移至存储寄存器，在存储寄存器中将它们逐行读出到串行寄存器中。这种安排允许同时读出初始帧和整合下一帧。帧转移架构的主要优势在于，它消除了电荷转移过程中快门的需求，从而提高了CCD的帧速率。
对于行间转移Interline（IL）阵列（图7c）中的每个有效像素行，都有一个对应的屏蔽转移行。曝光区域收集图像数据，并在积分之后，每个有源像素将其收集到的电荷迅速转移到像素的遮光部分。这样，当数据移至电荷转移通道时，相机即可获取下一帧。将阵列分成有效像素和遮蔽像素的交替行允许同时积分电荷电势和读取图像数据。这种布置消除了对外部快门的需求，并提高了设备速度和帧速率。微透镜的结合补偿了由于像素部分遮蔽引起的聚光能力的降低。每个透镜将原本会被铝掩模反射的一部分光导向像素的有效区域。
通过定义一个或多个代表样品中感兴趣区域的子阵列，可以提高读出速度。像素数的减少导致更快地读取数据。与简单地增加时钟速度的情况不同，这种增加的读出速率的好处是不会相应增加噪声。在称为像素合并Binning的时钟程序中，从指定的一组相邻像素中收集电荷，然后将合并后的信号移入串行寄存器。合并阵列的大小通常是可选的，范围从2x 2像素到大多数CCD阵列。使用像素合并的主要原因是为了提高信号噪声比和动态范围。这些好处是以牺牲空间分辨率为代价的。因此，像素合并通常用于图像分辨率不如快速的吞吐量和信号改善重要的应用中。
CCD增强技术
除了微透镜技术以外，还可以对CCD进行一些物理修改，以提高相机性能。当代生物学研究中使用的仪器必须能够检测低荧光团浓度和微小样本量所特有的微弱信号，应对低激发光子通量，并实现快速细胞动力学成像所需的高速和灵敏度。对探测器的要求可能相当高：超低检测极限，快速数据采集以及生成的信号与设备产生的噪声有明显区别。
大多数当代的CCD增强的结果是探测器背面变薄和/或增益寄存器电子倍增。背面变薄避免了从标准CCD像素上的覆膜吸收或反射的光子损失。而且，由于在氧化物硅界面处的复合，通常会损失由紫外线和蓝色波长在硅表面产生的电子，从而使传统的CCD芯片对高频入射光不那么敏感。使用酸蚀刻技术，可以将CCD硅晶片均匀地减薄到大约10-15微米。入射光被引导到并行寄存器的背面，远离栅极结构。电势累积在表面上，并将生成的电荷导向电势阱。背面变薄的CCD在整个电磁光谱范围内（通常是从紫外线到近红外波长）都表现出光子敏感性。背面减薄可以与FF或FT体系结构一起使用，并与固态电子倍增器件结合使用，可将量子效率提高到90％以上。
电子倍增CCD（EMCCD）是对传统CCD的改进，其中在串行寄存器输出和电荷放大器之间插入了一个电子倍增寄存器。该倍增寄存器或增益寄存器设计有额外的接地相，与标准的CCD水平寄存器（5-15伏）相比，该接地相产生了高电场区域和更高的电压（35-45伏）。通过高电场区域的电子成倍增加，由于碰撞产生电子的概率约为1％。倍增寄存器由4个栅极组成，这些栅极使用时钟电路施加电势差（35-40伏）并通过碰撞电离过程生成二次电子。当高能电荷载流子在创建其他电荷载流子时损失能量时，就会发生碰撞电离。当这在施加电场的情况下发生时，雪崩击穿过程会在寄存器中产生级联的二次电子（增益）。尽管产生二次电子的可能性很小（大约1％），但是倍增寄存器中的大量像素会导致产生数百或数千个电子。
传统的慢速扫描CCD可以实现高灵敏度和高速度，但是这样做会牺牲读出速率。在这些相机中，电荷放大器会限制读出速度。为了达到高速，电荷放大器的带宽必须尽可能宽。但是，随着带宽的增加，放大器的噪声也会增加。慢速扫描相机的带宽通常很低，这意味着只能以较低的速度（大约1MHz）读取它们。EMCCD通过在电荷放大器之前放大信号来规避这一限制，有效地将相对读出噪声降低到少于一个电子，从而提供了低检测限值和高速检测。因此，EMCDCD能够以良好的分辨率，大的强度范围和宽的动态范围快速生成低光图像。
CCD性能指标：相机灵敏度
关于CCD性能的术语灵敏度可以根据特定应用中使用的入射光水平进行不同的解释。在信号水平较低的成像场景中，例如在荧光显微镜中，灵敏度是指CCD检测微弱信号的能力。在高亮度应用中（例如，染色样本的明场成像），可以将性能作为确定亮图像中微小变化的能力来衡量。在光线不足的情况下，相机噪声是灵敏度的限制因素，而在光线较高的情况下，信号噪声会成为限制因素。
相机的信噪比（SNR）可以测量相机在单次曝光中可以检测到的信号电平之比，但是除非已知比率中的值，否则它无法确定弱光的敏感度或对大信号变化的敏感度。一个有2个电子噪声和2万电子满阱容量的相机将与一个有20个电子噪声和20万电子满阱容量的相机有相同的SNR（10,000：1）。但是，第一台相机对低信号更敏感，而第二台相机对大信号的细微变化将提供更好的灵敏度。不同之处在于每种应用的噪声类型。弱光相机受到相机噪声的限制，在这种情况下为2个电子，这意味着至少可以检测到约5个信号电子。高光照相机的灵敏度受到信号噪声的限制，在这种情况下，噪声为200,000的平方根（447个电子），表示信号的可检测变化约0.2％。
灵敏度取决于极限噪声系数，在每种情况下，CCD设备性能的粗略衡量标准是入射光信号与相机组合噪声之比。信号（S）被确定为入射光水平（I），量子效率（QE）和以秒为单位测量的积分时间（T）的乘积。
S = I × QE × T
在整个数字成像过程中会产生多种类型和来源的噪声。 它的数量和重要性通常取决于应用和用于创建图像的CCD的类型。 确定比率时考虑的主要噪声源是统计（散粒噪声），热噪声（暗电流）和前置放大或读出噪声，尽管其他类型的噪声在某些应用和类型的相机中可能很重要。 总噪声通常计算为读出噪声，暗电流噪声和散粒噪声（统计噪声）的总和，如下所示：
CCD的读出电子电路会产生前置放大或读出噪声。读出噪声由两种主要类型或噪声源组成，它们与CCD固态电子组件的操作有关。白噪声起源于输出放大器的金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET），在此MOSFET电阻会产生热噪声。闪变噪声（也称为1 / f噪声）也是输出放大器的产物，它起源于阵列元件的硅层和二氧化硅层之间的材料界面。
热噪声或暗电流产生的机理类似，是由于硅中的杂质会在硅带隙内产生高能态。热噪声是在表面状态下产生的，块状硅BulkSilicon中和耗尽区中产生的，但大多数是在表面状态下产生的。暗电流是半导体工作所固有的，因为热能使电子从价带逐步跃迁到导带，在导带中将它们加到信号电子上并由检测器测量。通常通过冷却CCD来降低热噪声，可以使用液氮或热电（珀耳帖）制冷器来完成。前一种方法将CCD放置在温度非常低以至于消除了明显的热噪声的氮气环境中。通常使用热电制冷来减少热噪声对相机总噪声的影响。珀耳帖（Peltier）型制冷器使用夹在两个金属板之间的半导体。当施加电流时，该器件就像热泵一样从CCD传出热量。
放大噪声出现在EMCCD的增益寄存器中，通常由称为噪声因子的数量表示。对于弱光成像系统，由倍增过程或增益引入的噪声可能是重要的性能参数。在某些情况下，电子倍增过程会放大本底以上的微弱信号，从而能够检测到和单光子事件产生的信号一样低的信号。在任何放大信号的过程中，添加到信号的噪声也会被放大。因此，冷却EMCCD以减少暗电流及其相关的散粒噪声非常重要。
每当我们承诺量化光子或光电事件时，由于光的量子性质，测量中都会存在固有的不确定性。光子的吸收是量子力学事件，因此吸收的光子数根据泊松分布而变化。该固有的统计误差从根本上限制了确定特定像素吸收的光子数量的准确性。这种不确定性称为泊松噪声，统计噪声或散粒噪声，由信号或检测到的光电子数的平方根确定。在低光荧光应用中，最亮像素的平均值可能低至16个光子。由于统计不确定性或泊松噪声，积分期间在势阱中收集的实际光电子数可能在12到20（16±4）之间变化。在代表较低样本信号电平的平均值中，不确定性变得更加明显。例如，如果平均值仅为4个光电子，则代表统计噪声的信号百分比将跃升到50％（4±2）。泊松或散粒噪声是固有的物理限制。统计噪声随着信号的增加而减少，因此只能通过增加计数的事件数来减少。尽管通常将量子效率与噪声分开考虑，但指示量子力学事件数的值减少意味着统计噪声或泊松噪声的增加。
量子效率Quantumefficiency (QE) 是衡量相机性能的指标，它确定了CCD检测到的光子百分比。它是光伏响应的特性，可以通过以下公式进行总结：
QE = ne / np
其中量子效率（QE）等于所产生的电子空穴对的数量，该电子空穴对的数量由检测到的光电子数量（ne）除以入射在像素上的平均光子数量（np）确定。量子效率将始终小于一。
所产生的光电子的数量取决于硅元素对入射光子的光伏响应，并取决于多种条件。在光子和硅相互作用期间产生的电荷量取决于许多因素，包括吸收系数和扩散长度。硅的吸收系数会随波长发生变化，更长的波长相比更短的波长渗透到更深的硅基板中。在临界波长（大于1100纳米）以上，光子的能量不足以引发光电效应。 450到700纳米范围内的光子在势阱位置和块状硅衬底中被吸收。耗尽区中吸收的光子的QE接近100％，而基板中其他位置的光子可能释放出移动效率较低的电子。
CCD的光谱灵敏度取决于在近UV至近红外波长范围内光敏元件的QE，如图8所示。为提高性能而对CCD进行的修改导致了其蓝绿色光谱部分的高QE。背面变薄的CCD可以超过90％的量子效率，从而消除了由于与电荷转移通道相互作用而造成的损耗。
詹姆斯·波利JamesPawley提出的CCD性能测量方法称为强度扩展函数（ISF），并测量强度测量中由于统计噪声引起的误差量。 ISF将A / D转换器测得的数字与单个像素的亮度相关联。首先通过对单个像素进行一系列测量来确定特定检测器的ISF，在单个像素中，光源照度均匀且积分周期相同。然后将数据绘制为直方图，确定光子的平均数和半峰全宽（FWHM）点的值（标准偏差）。
ISF等于平均值除以计算为标准偏差的FWHM。该值表示为光子，表示已针对QE和光电子与其存储在存储器中的代表数之间的已知比例关系进行了校正。检测到和数字化的数量与光电子数成正比，而不是与光子成正比。因此，ISF是由于统计噪声引起的输出信号误差量的度量，统计噪声随着QE（光电子与光子之比）的减小而增加。统计误差表示在已充分降低了读数和热噪声的成像系统中可达到的最小噪声水平。
入射光子到电子输出信号的转换是CCD中的基本过程。光输入和最终数字化输出之间的理想关系是线性的。作为一种性能指标，线性度描述了最终数字图像如何很好地表示样品的实际特征。当像素的检测强度值与存储的数值和图像显示中像素的亮度线性相关时，样品特征就可以得到很好的表示。线性度衡量CCD在其阱深范围内响应光子输入的一致性。大多数现代CCD都显示出很高的线性一致性，但是当像素接近其满阱容量时，可能会发生偏差。随着像素变得饱和并开始产生光晕Bloom或溢出到相邻像素或电荷转移通道中，信号不再受更多光子添加的影响，系统变为非线性。
CCD线性度的定量评估可以通过使用均匀光源通过增加曝光时间来生成曝光集来进行。将得出的数据与平均信号值作图，作为曝光（积分）时间的函数。如果该关系是线性的，1秒曝光产生约1000个电子，这表明10秒曝光将产生约10,000个电子。线性偏差通常以百分比的分数来衡量，但是在整个动态范围内，没有一个系统是完全线性的。在低光，定量应用和执行平场校正中，线性偏差尤其重要。线性测量结果因制造商而已，可能会报告为符合或偏离理想线性条件的百分比。
在弱光成像应用中，荧光信号比激发光弱大约一百万倍。由于需要使光漂白和光毒性最小化，因此信号的强度进一步受到限制。当量化生物荧光成像的少量光子特征时，该过程会出现光子匮乏，但也要承受与枚举量子力学事件有关的统计不确定性。由于不确定性量随强度的平方根增加而增加，线性度的测量更加复杂。这意味着统计误差在图像的最暗区域中最大。使用反卷积算法处理数据通常是光子受限成像应用中解决此问题的唯一方法。
撰稿人
Kristin L. Hazelwood, Scott G. Olenych, John D. Griffin, Christopher S. Murphy, Judith A. Cathcart, and Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.
