显微数字成像中的色彩平衡

即使是经验丰富的显微镜专家，无论他们使用的是传统的摄影胶片乳剂还是较新的固态数字相机系统，在光学显微镜中获取准确的色彩平衡图像都可能是一个挑战。 电子图像捕获技术的使用与传统的基于胶片的显微照相一样依赖于相同的光属性，但是执行白平衡调整以实现色彩平衡的功能是电子图像传感器的独特功能，对于从显微镜捕获数字图像的研究人员来说根本不直观。

图1-3200K和5500k照明下的白平衡校正

当将捕获的数字图像与通过显微镜目镜观察到的图像或在计算机监视器上实时观察到的图像进行严格比较时，颜色变化通常非常惊人，并且试图调和两者之间的差异可能会令人沮丧。造成这种差异的一个因素是，在成像过程中，人类视觉系统会潜意识地适应成像条件的变化，并且通常在记录图像并评估静态版本（通常是在不同的观看环境）之前不会意识到色彩再现问题，。

图1显示的是在不同的照明色温条件下，同一显微镜视野记录的一系列数字图像。该标本是粘附的印度Muntjac鹿皮成纤维细胞的单层培养物，在差分干涉对比（DIC）显微镜中以相对较低（波长的二十分之一）偏光延迟下观察到。在目镜中，当调整Nomarski棱镜以实现图1所示的光程差时，细胞培养物呈现中性灰色，并在光路上添加了色彩转换滤镜将钨卤素灯的色温从3200K提高到大约5500K（日光值）。

如果没有色彩转换滤镜，图1中的DIC样品会呈现中性灰色，但是当通过显微镜目镜观察时，会呈现出明显的整体黄色调，具有白炽灯照明的特征。如果未激活数字相机的白平衡功能并将其应用于当前的显微镜配置，则在这些条件下捕获的图像似乎也呈现出整体黄色偏光（图1（a））。在光路中插入色彩转换滤镜后，在目镜中会呈现出带有淡蓝色调的图像，并且在没有白平衡校正的情况下捕获的相应数字图像会保持或放大这种色移（图1（c））。如图1（b）所示，将白平衡算法应用于钨丝灯或日光平衡照明下拍摄的图像，可消除由于色温影响而产生的着色。注意，根据照明色温，算法采用不同的色彩校正值来平衡图像的色调质量。钨丝照明需要增加蓝色，减少红色校正值，而日光照明则相反。

在与光学显微镜耦合的数字相机系统获得的图像中实现适当的色彩平衡取决于许多因素，首先要建立正确的照明条件和精确的显微镜光学对准，然后在图像捕获阶段达到顶峰。白平衡调整在获取所需图像中的作用尤为重要，该控制功能可用于捕获样品最真实的再现，或有意修正样品的表示，以校正人工制备样品时产生的不想要的色偏。

从概念上讲，需要对白平衡进行粗调，才能将图像传感器的响应带入适用于一般照明条件的范围内（类似于选择胶片类别），而精细的修改则有点类似于在胶片摄影中使用色彩补偿滤镜。即使当照明源和检测器的响应匹配时，通过显微镜的光通常也会被样品和光路中的任何其他组件以某种无法预测的方式改变。因此，获得的最终图像的色彩平衡可能与预期的结果有所不同。至关重要的是要了解不同的样品，甚至是样品的局部区域，它们都会对成像光产生独特的影响。因此，如果需要精确的色彩平衡，则必须小心控制诸如白平衡调整之类的变量。

色彩平衡图像的一般概念

光学显微镜中的图像形成基于光的基本特性，包括产生视觉上感知的颜色的强度和光谱特性以及相关的色温值。色温的属性可以相对于标准参考照明光源精确定义，并且可以通过仪器测量，但是在预测如何在给定成像条件下呈现每个标本方面并不可靠。此外，当在相似条件下观看时，具有相同色温的光源可能具有截然不同的光谱组成并产生实质上不同的图像。使这种情况更加复杂的是，增强对比度的辅助组件可能会引入显微镜光学系统的影响变化很大。明场，暗场，相衬，DIC，偏振光，霍夫曼调制对比和荧光照明都呈现出不同的色彩平衡校正表现，通常必须通过单独考虑样品和照明条件来解决这些问题。

图2-使用对比增强技术的色彩平衡错误

图2中显示的是在变化的照明色温和对比度增强方法的条件下捕获的几个数字图像。在钨-卤素照明下曙红和苏木精染色的人类睾丸癌（精原细胞瘤）薄切片如图2（a）所示。请注意，与恰当的色彩平衡图像相比，整体上泛黄的颜色覆盖了整个图像，并使染色的部分变色（如图7（b）所示）。当日光颜色转换滤镜未插入光路时，这是在明场显微镜中发生的常见错误。在不对数字相机进行白平衡校正的情况下，在光路上添加蓝色日光滤镜会导致整体蓝调，如图2（b）所示。这张单层培养中的活的人宫颈癌细胞图像显示了相机未正确平衡颜色时出现的蓝色。在拍摄软件上应用白平衡算法将可以在显微镜目镜中观察到的灰度值渲染图像。

当显微镜的照明无法平衡日光色温并且相机系统的白平衡没有正确调整时，使用其他对比度增强技术获得的图像也会产生类似的问题。在图2（c），2（d）和2（e）中，分别用差分干涉对比（DIC），偏振光和霍夫曼调制对比拍摄的图像，其色彩平衡值均偏向偏暖（黄色）的色相。 。在DIC图像（图2（c））中，特征显得浑浊，并且正常的灰度色调以棕色和红色的各种阴影呈现。同样，重结晶尿素的偏振光图像（图2（d））显得太绿了，而放射虫的霍夫曼调制对比图像（图2（e））却具有明显的绿色背景（和高光）。荧光图像（图2（f））通常不会出现色彩平衡问题，这主要是因为它们被小范围段波的波长所支配。

大多数人在日常活动中都很好地认识到色彩平衡或色彩还原的变化现象，并且通常认为这是自然现象，不需要任何干预。例如，人们非常熟悉日落时日光的黄金品质，事实是烛光中的颜色与荧光办公室照明相比显得截然不同。人类的视觉系统通过结合眼睛的感觉反应和大脑对信号的解释来发挥功能，以适应光线颜色和强度的变化。因此，在广泛变化的照明条件下，白色物体被解释为白色。通常，如果正确感觉白色，则其他颜色和色相也能准确被识别。相反，图像传感器，无论是传统胶卷还是现代数字相机都会对在曝光时刻固定照明产生的响应。产生的图像的颜色质量将取决于设计到胶片中的颜色敏感层的特定响应，或者取决于固态传感器的各个颜色感应元件（像素）的灵敏度。无论使用哪种捕获方法，都可以通过在照明或成像光路引入彩色滤光片来修改图像的颜色平衡，但是数字方法具有明显的其他优势，即可以对传感器响应进行精确的电子调节。

数字相机白平衡基础

用于记录图像的传感器，无论是传统的摄影胶片还是数字成像设备，通常设计或调整以使其基线响应与广泛的一般照明类别相匹配。例如，摄影胶片通常分为两大类，适用于白天日光照明或钨丝灯照明，并通过使用适当的滤光片对关键应用的胶卷响应进行微调。固态传感器通常是电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）光电二极管检测器，能够对其进行电子调节，以使其响应特性与各种照明源相匹配。

CCD或CMOS探测器的各个光敏元件本质上是单色的，通过将入射光依次通过红色，绿色和蓝色滤光片传递到整个传感器上来实现其色敏性（每种颜色产生单独的图像，然后将其组合），或通过微型聚合物薄膜滤光片将其以马赛克图案放置在阵列的每个像素上。最常见的滤光片排列是红色，绿色和蓝色滤光片的有序镶嵌阵列，该阵列在整个传感器阵列上重复G-R-G-B模式。这种布置称为Bayer滤光片图案（见图3（a）），其中包含的绿色元素是红色或蓝色的两倍。额外的绿色传感器像素使成像设备可以更接近人类视觉系统的颜色响应，该系统在绿色光谱区域（约550纳米波长；图3（b））的灵敏度达到峰值，从而有助于输出视觉上可接受的色彩平衡的图像。通过白平衡控制功能可以实现对来自传感器阵列的相应像素（或单色图像）的单独的红色，绿色和蓝色信号幅度进行调整，以实现所采集图像的颜色平衡。一些相机系统通过软件而不是硬件控制或除了硬件控制之外还执行这些调整。

图3-拜耳滤波器阵列模式和光谱图

设计用于通用用途的数字相机为许多显微镜专家所熟悉，并且越来越适合于连接到显微镜，以作为专用研究级成像系统的经济替代品，尽管它们的功能通常更为有限。因为将用于常规目的的数字相机所涉及的技术可以扩展到理解诸如显微镜应用中的白平衡调整之类的因素，所以最好首先考虑非技术的情况。控制白平衡调整的基本概念对于一般的摄影应用和显微镜成像都是相同的。

传统的数字相机通常为用户提供许多不同的白平衡设置，这些设置可以选择为“预设”。这些可能对应于广泛的照明类别，例如日光（晴天或阴天），钨丝灯，荧光灯或各种其他照明方案。许多相机允许对预设值进行微调，以实现图像更精确的色彩平衡。某些相机具有附加功能，可以通过参考白卡，墙壁或其他对象（如果包含在图像中，则应表示为白色）来调整白平衡。在实践中，相机的位置应使白色物体充满视野，并通过操作菜单中的开关设置或选择（取决于特定的相机）来启动白平衡调整，然后相机会对图像进行适当的传感器调整，将目标渲染为白色。

在获取图像期间使用的相同照明条件下，通过参照定义的白色物体进行调整可以提供高度准确的色彩平衡校准。但是，如果照明发生变化则必须重复该过程。高级摄影师通常通常选择通过使用白平衡设置（而不是与照明相匹配的设置）来修改其图像，以获得理想的美学效果。例如，与使用“正确”白平衡获取的图像相比，可以使图像显得更冷或更温暖。如果要进行精确的场景再现，则这种效果当然会被认为是错误的，类似于在钨丝灯照明中使用日光平衡胶片，反之亦然。

通常在关键应用中应避免使用流行的色彩平衡技术，在消费类相机中通常称为自动白平衡调整。该方法旨在在获取图像时应用于图像图场，通过评估整体视场，对色相呈现的光值求平均并尝试对任何整体色偏进行平均或归零来发挥作用。自动平衡技术的缺点是，任何视场中出现的颜色值都代表色调的“平均”分布，这些色彩组合起来产生中性的灰色或白色。实际上，如果求和的像素响应与编程的（预期的）总体平均值不同，则相机进行的白平衡调整将不会产生准确的色彩再现。

在显微镜下观察到的典型标本的颜色分布差异很大，并且通常表现出单一的主要颜色（尤其是荧光）。在主要显示红色的组织染色标本上进行自动白平衡调整可能会产生与蓝染色制剂相同的颜色平衡。两者均不会产生准确的标本表示。相机电路尝试平衡探测器的响应，平均的总体颜色值将在不同的样品上产生明显不同的结果，尤其是在给定视场具有强烈或主导色彩的情况下。当然，有一些标本示例可以通过自动白平衡产生可接受的结果（很可能是那些具有很大比例的白色或灰色区域的标本），但是该技术缺乏使其常规使用所需的可重复性。

显微镜中的白平衡调整

在考虑优化白平衡的不同方法时，很明显，某些技术无法适应光学显微镜的约束和要求。将预设值用于特定照明类型时，假设光源的特性是固定的，并且具有色温和其他光谱质量的标准值。当使用卤钨灯时，显微镜中通常的做法是改变灯电压以控制光强度或尽量减少热量的产生。这样做会产生照明色温的变化，如果在数字相机上使用钨丝灯的标准预设值，则会导致色彩平衡不正确。色彩再现变化的另一个来源是随着使用寿命期间灯泡老化而产生的颜色变化。

对于日光（大约5500K）色温区域，进行最佳平衡的光源也存在类似的问题。 不仅“日光”的色温是可变的，而且很少有人工来源能够精确地模仿日光的光谱质量。 从理论上讲，这些困难可以通过允许自动电路校正较小的照明波动来至少部分克服，但是其他问题通常使此方法不受欢迎。 通过自动评估像场，局部样品变化会在色彩平衡上产生很大的误差。 通常，对于大多数显微镜应用而言，最好的方法是将白平衡评估限制在精心选择的图像区域或其他合适的目标上。

图4-用于白平衡调整的点和选取框选择区域

当使用数字捕获设备在光学显微镜中对彩色样品成像时，获得正确的色彩平衡以提供样品的真实表示通常是主要目标。通常会故意偏离此策略，仅是为了纠正标本制备过程中产生不良色偏的问题。大多数科学级数字相机，包括专门为显微镜设计的数字相机，都依赖于参考选定的色彩值来调整白平衡。在透射照明中，从样品场中选择适当的区域（通常是白色或中性灰色），或者将样品从光路中移出仅在照明场上进行调整。为了在显微镜中利用反射照明进行白平衡调整，可以在显微镜载物台上放置白色或中性灰卡（或纸的一部分）来代替样品。随后通过测量从白卡表面反射的光来获取白平衡设置。

设计用于显微镜的大多数数字相机是通过主机上的软件控制的，通常将其配置为与多种显微镜功能交互。例如，尼康DXM1200数字相机系统的软件界面代表了目前用于实现白平衡调整方式的商业产品。当在用户界面中激活白平衡调整窗口时，将提供用于在视场中选择区域以供相机系统评估白平衡的选项。应该仔细评估显示监视器上的实时图像看是否有适当的白色或中性灰色区域，以用作图像传感器的参考点。如果监视器上显示的图像的色偏与在显微镜目镜中观察到的色彩平衡不同，则必须调整相机系统的白平衡，以呈现样品的准确图像。在理想情况下，当选择合适的样品区域进行白平衡调整时，相机的色彩平衡电路将消除显示的色偏。

图4中显示了可用于设置数字相机白平衡算法的标本区域的几个典型示例。标本是活的纤维目细胞培养物的差分干涉对比图像（图4（a）），四倍染色的马铃薯组织中的淀粉颗粒薄切片在明场照明下（图4（b））的图像和相差显微镜下的人体红细胞（图4（c））。 用红色勾勒出每个图像上适合使用区域技术进行白平衡调整的区域，而黄色箭头表示图像上的特定点，当选择单个像素点时可能会产生令人满意的白平衡校准。

交互式教程-数字成像中的色彩平衡

数字相机上的白和黑平衡设置可用于调整色彩平衡。

选定为白平衡参考的区域应尽可能大，并且应避免渗入固定介质中的样品染色的着色效果。在许多系统中，白平衡调整软件都可以选择图像中的单个点（像素），也可以选择更大的区域（可以通过使用鼠标光标选取框选择来指定）。通常，通过选择尽可能大的区域可获得更好的结果。如果选择单个点进行调整，结果的变化可能会大得多，因为红色，绿色和蓝色像素强度的局部变化的组合会影响白色的整体视觉效果。通过选择较大的区域，可以在传感器阵列中的大量像素上获得平均值，并提高了实现可接受的色彩平衡的可能性。选择参考区域后，将开始白平衡调整，并且相机系统将使用算法或查找表（LUT）来设置适当的电子值（例如每种颜色成分的传感器增益），以产生中性色或白色值。

如前所述，数字图像的色彩平衡在很大程度上受CCD或CMOS图像传感器收集的波长光谱的影响，而不管传感器是安装在照相机，望远镜，激光工作台还是显微镜中。在这些采用固态器件的彩色数字相机中，通常需要进行一系列的平衡调整，以产生符合照明光源色温的可接受的彩色图像。成功实现适当色彩平衡应该考虑的一些准则：

• CCD图像传感器对红外光敏感，只有滤除较长波长的红外光，才能实现可见光成像的最可靠性能。 某些系统可能在相机内装有红外阻挡元件，但如果确定情况并非如此，则应在它们到达图像传感器之前添加适当的滤光片以排除这些波长。
• 对于在标本图像上调整白平衡的任何显微镜配置中，空白标本载玻片或反射光参考（例如白色表面）上，显微镜都应对准光学系统以正确地进行科勒照明并准确聚焦在标本平面上。 确保这些条件可以最大程度地减少照明不均匀或视野中像差引起颜色异常所导致的问题。
• 通常图像传感器的性能在较高的色温区域内是最佳的，数字成像要求钨卤素照明源必须在建议的电压调整范围的上限下照明。 应始终使用中性密度滤光片进行任何必要的照明强度降低，而不是通过降低照明灯的电压来进行。 类似地，如果将摄影通常在日光平衡彩色胶片上使用的，用于色彩平衡的色彩平衡滤镜插入照明光路，数字相机最容易实现适当的色彩平衡。 尼康将此滤镜称为NCB（中性色平衡），尽管其他制造商对具有相同用途的滤镜使用了不同的名称。
• 与选择极亮区域作为白色参考相比，在样品区域的中性灰色区域调节白平衡可能会产生更准确的结果。 由于一种或多种分量（RGB）颜色过度饱和，导致图像完全被“冲洗掉”或超出了传感器的动态范围。 由色彩平衡电路在这样的区域上执行的增益补偿可能会产生不准确或不可再现的结果。 灰色区域（具有中性密度）是由红色，绿色和蓝色像素传感器（或单独的RGB彩色图像）的信号电平近似相等产生的。 因此，基于中性区域的精确色彩平衡更容易实现。
• 几个变量会影响在显微镜中获取的图像的色彩平衡，因此了解它们之间的相互关系对于获得可接受的结果非常重要。通过成像软件界面进行的曝光设置是通过调整图像传感器电路的增益来进行的。由于白平衡调整还通过RGB传感器的选择性增益补偿来实现，因此在开始白平衡调整之前，应将曝光水平设置为近似正确的值。如果在设置了白平衡校正后改变了曝光时间，或需要对增益和偏移进行其他更改，则建议重复白平衡设置步骤，因为所有这些因素都会相互影响。类似地，对影响光属性的显微镜组件进行的更改（例如光圈调整，滤镜更改和切换物镜）可能会改变白平衡，并且需要再次执行校正才能获得最准确的图像。
• 如果特定的应用需要对选定样品中的一个样品与另一个样品（根据标准程序准备的样品）之间的颜色判断或进行比较严格的判断，则重要的是不要对每个样品重复白平衡调整。在这种情况下，最好的程序是单独对照明进行初始白平衡校准（在适当的位置放置空白显微镜载玻片），然后获取单个样品的图像，并进行必要的曝光调整。再次用空白载玻片代替样品后，应在照明区域上重复执行白平衡程序，而无需更改曝光或显微镜配置。然后，应在相同的白平衡，曝光等设置下对被比较的样品进行成像。如果需要更改曝光，则应将其最小化，以免影响色彩平衡。为了重申此类应用中的关键概念（正在比较样品之间的颜色再现以进行测试或诊断的目的），白平衡调整应仅在光源上执行，而不应针对每个样品进行校正。因此，可以比较每个样品在显微镜照明源上产生的色彩效果。
• 光学显微镜中使用的某些照明和对比度增强技术在调整数字捕获系统的白平衡方面提出了其他挑战。 偏振光，暗场和荧光方法通常存在视场，在这种视场中样品在深色背景上以深饱和的颜色呈现，几乎没有白色区域。 一些相机系统提供了一种机制，可以为这种没有合适的白色或中性灰色区域类型的成像情况设置暗平衡或黑平衡。 此方法为传感器响应建立基线设置，并可以提供令人满意的色彩平衡。
• 深色背景标本成像的另一种技术是在取下标本后在照场上进行白平衡调整。 但是，对于高度饱和，深色的标本，正确的成像曝光可能需要非常明亮的照明或相对较高的相机增益设置。 如果在没有样品的情况下在明亮的照明场上进行白平衡调整，则可能会限制其准确性。 为了使白平衡电路能够以类似于样品所存在的亮度水平（以及大约正确的曝光设置）评估亮度，可以在白平衡调整过程中将中性密度滤光片插入光路，然后换成标本进行实际成像。 为了选择接近样品透射曲线的中性密度滤光片，需要进行一些实验。

白平衡操作

经常遇到以下情况：按照常规规程在图像捕获过程中无法达到可接受的白平衡。在这些情况下，有时可以使用非标准技术，这些技术将有效地“欺骗”相机的白平衡功能以产生特定的色彩平衡，该色彩平衡可能会或可能不会被认为是正确的，但会达到所需的效果。如果即使该策略也无法提供可接受的色彩再现，或者最初获取的现有图像色彩平衡较差，可使用尼康NIS-Elements等软件进行的采集后图像处理可以提供一定程度的校正。

“强制”白平衡功能的基本技术是偏离其正常行为对除白色以外的其他颜色执行白平衡。如果将非白色色调呈现为白色，则传感器增益电路将尝试将输出推向相反（或互补）颜色，以补偿非白色色调。实际上，红色，绿色和蓝色通道的相对大小发生了变化，以将颜色再现为白色，同时将图像中的其他颜色推向相同的互补色相。例如，经常会通过在红色参考目标上进行校准来平衡具有偏红色调的图像，而该图像偏红色的图像无法通过相机的电路进行校正。为了将红色目标重现为白色，传感器的蓝色和绿色像素输出都增加了，增加了补偿红色所需的互补青色。通过类似的逻辑，在黄色目标上进行颜色平衡会导致在整个图像中添加蓝色。这项技术在色彩平衡中的应用需要仔细分析，以确定可以有效添加或减少哪些色调以纠正图像问题。

图5-在数字图像中强制白平衡校准

图5中显示的是一些标本的数字图像，这些标本由于掩膜或制备错误而出现偏色。图5（a）所示的集成电路（以反射光差分干涉对比成像）在表面上包含氮化硅钝化层，其作用类似于黄色滤光片。从芯片表面反射的波前必须在到达物镜之前穿过涂层，许多较短的波长（蓝色和绿色）被阻挡。通过在图5（a）中的黄色箭头指示的点上校准数字相机的白平衡，可以大大消除钝化层产生的黄色偏光，从而产生具有出色色彩平衡的图像（图5（b））。同样，图5（c）中所示的（美国椴木树）过度染色的薄部分可以用相同的方式进行校正。在没有组织的区域中选择一个像素进行白平衡校准（请参见黄色箭头；图5（c）），将产生具有干净的白色背景和色彩饱和度很好的图像（图5（d））。荧光样品制备经常会使未结合的荧光团渗入周围的固定介质中，从而产生类似的“过度染色”效果，如图5（e）所示为蕨类植物的薄切片。在一个像素上（图5（e）中的黄色箭头）设置数字相机的带有反染色功能白平衡校准，通常会减少最终图像中的背景荧光量（图5（f））。

为了应用上述技术，各种彩色滤光片通常可用于透射光配置。 专为彩色照片打印而设计的滤光片组适用于此目的。 这些滤光片组在每种主要颜色中包含一定的密度范围，可以组合生成所需的任何色相。 对于反射光显微镜，非白色平衡需要合适的反射颜色参考。 目标不一定要符合任何颜色标准，通常需要进行实验才能产生所需的结果。 可以使用任何彩色的反射表面，但是希望有宽范围可用的色相和饱和度。 家居中心或油漆商店提供的油漆颜色样品卡非常适合该用途，因为它们几乎可以提供各种可能的颜色变化。 在某些情况下，样品本身的选定区域可用于设置彩色白平衡校准。

无论是在透射光中使用的滤光片，还是在反射光中使用的反射目标（例如油漆样品卡），操纵相机白平衡功能的概念都是相同的：非白色的白平衡校准会导致相机电路移除目标颜色，并将其渲染为更中性的灰色调。在大多数情况下，只需要一个细微的变化，实验将确定目标的色相和饱和度，从而对整体图像平衡产生必要的变化。淡蓝色平衡会导致整体变暖效果，或向红色转变。相反，采用浅红色作为参考的色彩平衡会导致偏蓝向较冷方向移动。其他颜色校正遵循相同的一般逻辑。在任何给定的颜色上执行白平衡都会导致使相机的电路将颜色平衡移向互补色。重要的是要强调，当常规方法失败时（由于与特定的标本制备，光源或成像设备有关的原因），这些非常规的色彩平衡技术是实现所需结果的潜在机制。在这些情况下，仍然可以通过抵消相机对样品调色板的响应来获取可接受的图像。

虽然始终最好是在最初获取具有适当色彩平衡的图像，但是在获取后，通过图像编辑软件应用后期处理操作，也可以进行一定程度的校正。这些步骤不能代替适当的相机内白平衡，必须谨慎使用，以免造成样品再现时出现不可接受的变化。色彩平衡的一般更改将影响图像的所有区域，但这有时是可以接受的折衷方案，因为较小的更改会产生相对较大的背景色调变化，同时对更鲜艳的样品特征影响较小。

在图像编辑程序中对色彩平衡进行的调整可以采用不同的形式，具体取决于所需的控制级别。通过更改每个通道的输入和输出值之间的关系，可以直接对红色，绿色和蓝色通道进行操作，也可以对组合的RGB信号进行修改。采集后颜色平衡过程的详细信息可能会根据方法和所使用的特定软件而有所不同。下面介绍针对流行的软件包AdobePhotoshop的几种图像调整技术，尽管可以使用提供类似功能的任何图像处理程序。

图6-使用Photoshop色阶设置进行色彩平衡调整

许多图像编辑程序提供了出众的能力和多功能性，并且可以对色调平衡，饱和度和其他特征进行高度控制。在许多情况下，快速简单地改变色彩平衡就足以解决较小的问题，在Photoshop中，可以通过“图像”调整菜单的“色阶”或“曲线”窗口访问。在任一窗口中，将出现三个吸管图标，可以通过单击鼠标单独选择它们。选择吸管工具后，可以通过单击图像区域来使用鼠标光标来采样图像像素的颜色值。左右滴管将建立白色和黑色图像值，而中央滴管工具将控制图像的中间调（灰度）值。中间色调灰度选择器提供了最直接的方法来快速校正色彩平衡问题。

图6显示了在Photoshop中使用“色阶”功能进行的色彩平衡调整，用于在显微镜中捕获的几个数字图像。图6（a）中的纤维母细胞是在卤素钨灯照明下记录的，在光路上没有使用日光滤镜，因此整体呈淡黄色。在没有细胞结构的区域（图6（a）中的黄色箭头）使用中间色调吸管设置，可以从处理后的图像中有效去除偏色（图6（b））。另外，白色水平的吸管设置可以消除在钨卤素灯照明下过度染色的薄部分中产生的黄偏色（图6（c）和6（d）），而黑色水平设置用于减少过度染色的水平。荧光图像（图6（e）和6（f））。在后一个示例中，可以使用滴管工具在具有不同程度的红色背景水平的像素之间进行选择，以最大程度地减少不需要的荧光。

与“色阶”功能类似，Photoshop软件中的“曲线调整”选项提供了一种简单直接的方法，可以通过在图像区域中进行选择来指定白色，黑色和灰色值，并可以交互式调整图像的伽玛值。如上所述，还可以通过“色阶”选项以类似的方式执行颜色平衡调整。打开要修改的图像文件后，从菜单栏中选择“图像/调整/曲线”，这将打开“曲线调整”窗口。通过使用鼠标光标单击来选择中间的吸管按钮，然后评估图像以标识应呈现为中性灰色调的区域。单击该区域应使图像达到近似正确的色彩平衡。

使用“色阶”或“曲线Photoshop”工具时，请确保已选中“预览”复选框，以使更改立即反映在图像中以进行评估。通过重复单击图像中的不同区域，通常可以找到合适的灰度值，以产生可接受的色彩平衡。在某些情况下，图像中没有合适的灰度或中间色调值，在这种情况下，黑色或白色级别的吸管选择器可能会产生更好的效果。这些方式类似于使用中间调平衡操作。在选择图像中的黑色或深色区域之前，应先单击左侧的滴管按钮（在软件中显示为用黑色墨水填充的一半），而单击右侧的滴管则可以平衡图像中的白色区域。通过实验，通常可以对各种色彩平衡不正确的数字图像实现可接受的非平衡色彩校正。

调整色彩平衡之后，可以通过操纵伽玛曲线特性来改变图像的亮度和对比度。在“曲线”窗口中的图形区域可通过在拖动时用鼠标光标单击并按住来将曲线重新设置为任何形状。通过对组合的RGB曲线进行操作，最容易产生图像亮度和对比度的总体变化，这对色彩平衡（先前已调整）的影响最小。但是，可以通过从下拉菜单中选择每个通道，并通过使用鼠标光标拖动来重塑该通道的曲线来更改单独的红色，绿色和蓝色通道的灰度系数。当然，对各个颜色通道的这些调整将影响相对颜色值，并提供另一种微调和评估颜色平衡变化的技术。

当达到适当的色彩平衡时，在关闭“曲线”调整窗口（或其他图像调整功能）之前，可以保存已应用的校正用于其他图像（例如，在类似条件下已获得的其他图像）。即使没有适当的中性或白色区域，该技术对于一系列具有相似色彩平衡缺陷的图像应用也可能非常有价值的。如果一系列图像中有一个图像具有适当的灰度值进行平衡，或者最初可以通过曲线操作进行校正，则相同的校正通常适用于相似的图像。要应用保存的校正，将目标图像打开，然后从“曲线（或色阶）”调整窗口中加载保存的文件。一旦应用了校正因子，就可以对图像进行评估，以确定是否需要进行其他曲线调整。

图7-使用Photoshop曲线设置调整色彩平衡

用Photoshop曲线功能校正的一系列数字图像如图7所示。图7（a）中被染色的人体组织呈黄色，通常在曙红和苏木精染色的标本中出现。使用白色水平吸管工具选择背景区域（图7（a）中的黄色箭头）可以以类似于钕镨混合物Didymium滤镜和传统胶片的方式以适当的色彩平衡渲染图像（图7（b））。通过选择背景区域以使用中间色调吸管进行曲线调整，可以去除（图7（d））中用日光滤光片在光路中记录的相衬图像中出现的偏蓝色（图7（c））。最后，利用中间色调吸管工具轻松地去除了放射虫骨架的霍夫曼调制对比度图像中的绿色背景（图7（e））（图7（f））。

一种称为近似颜色一致性的现象使个人能够在心理上纠正照明的变化，以使物体在“已知”为白色的情况下看起来是白色的。这种色彩再现的适应程度取决于视场中是否存在参考光源。在日常情况下，如果观看者沉浸在主要的发光体之中或被包围时，则很容易进行调节。例如，在阳光下在户外观看的一张白纸被视为白色，如果将其带入室内并在昏暗的钨丝灯下观看，它仍会呈现白色。尽管在白炽灯下观察时纸张会反射更多的长波黄光和红光，但仍会发生这种潜意识的调节。在观看彩色照片或电视时，通常不会进行色彩平衡调节，因为周围的环境中存在其他用作参考的光源。通常，物理现实和感知之间存在许多可能的变化，了解这些因素对于在显微镜中捕获的图像进行正确的色彩平衡很重要。

因此，在评估和调整色彩平衡时，最后要考虑的是观看环境对色彩感知的影响。如果正在计算机监视器上查看图像，则应在计算机软件以及硬件方面调整监视器的亮度，对比度等，仔细校准监视器的显示参数。如果使用一个以上的监视器，例如，如果一个显示器专用于显微镜上的数字相机，而另一个显示器与打印机或其他输出设备一起使用，这些变量就特别重要。当通过比较涉及不同的显示方法或在不同的照明条件下进行颜色判断时，必须考虑这些因素。例如，在监视器上观看捕获的图像可能会导致色彩平衡的不同印象，这取决于监视器是在昏暗的房间中使用，还是在日光或明亮的荧光灯照射下的房间中使用。同样，在目视评估的显微镜载玻片是否有整体色偏，例如由染料渗入固定介质所导致的那些，在举起载玻片在窗口观察与使用钨灯在显微镜下观察时会出现很大不同。在光学显微镜中获取正确的色彩平衡图像最终涉及相互作用的组件，这些组件决定了在捕获过程中如何记录样品颜色以及在捕获之前和之后如何感知样品颜色。

总之，在显微镜照明源和胶片乳剂或图像传感器校准之间缺乏适当的色温平衡是显微摄影和数字成像中出现意外色偏的最常见原因。如果光源的色温对于胶片或传感器特性而言太低，则所得到的显微照片和数字图像将总体上泛黄或泛红，并显得温暖。另一方面，当光源的色温太高时，生成的图像将呈现蓝色，并且看起来很冷。不匹配的程度将决定这些颜色偏移的程度，差异较大会导致颜色变化的极端。固态数码相机系统会产生相同的效果。尽管这些色彩变化看起来很麻烦，但始终可以通过正确使用转换和光平衡滤镜或通过适当校准数字相机的白平衡电路来轻松纠正它们。

撰稿人
Thomas J. Fellers and Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.