介绍

荧光显微镜中的分辨率定义为样品上两点之间仍可区分的最短距离。这主要由两个因素决定；显微镜分辨率是显微镜可以分辨的最小物体，而相机分辨率是相机检测显微镜可以分辨的物体的能力。

显微镜的最大分辨率是物镜数值孔径和样品发射波长的函数，而相机分辨率则完全由像素大小决定。

但是，荧光显微镜的分辨能力最终受到光的衍射极限的限制，例如，当使用绿光（510 nm）时，其衍射极限约为220 nm。这为可以分辨的特征设置了下限。因此，在标准荧光显微镜中，通常使用能够达到此下限的显微镜设置来检测最小的可分辨物体。尝试使用常规显微镜无法解决低于此分辨力水平的问题，只有使用超分辨率技术才能打破光的衍射极限。

显微镜分辨率

衍射极限点

光以波的形式传播，因此当使用透镜将其聚焦到一个小点时，无论物镜的质量如何，该焦点的大小都会比实际的荧光团大。

发生这种情况是因为荧光发射的波前在物镜孔径的边缘处发生了衍射。 这有效地将波前散开，将荧光发射扩大为衍射图样，其中心点大于原始荧光团（图1）。

衍射极限光斑的大小约为发射光波长的一半，但由恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）在1873年确定的完整方程为：

d是衍射极限光斑的大小，λ是所用光的波长，2NA是物镜数值孔径的2倍。

对于在约510 nm处发射的GFP和高数值孔径（NA 1.4）物镜而言，通过显微镜解析的荧光团大小将为182 nm。 这比实际的荧光团大得多，实际的荧光团可能只有2 nm。

艾里斑Airy Disks

衍射极限点采用以乔治·比德尔·艾里（George Biddell Airy）命名的圆盘形状的艾里斑（图2）。 它包括一个明亮的中心点，周围有一系列衍射环。 中心点的大小取决于所发射的光的波长和物镜的数值孔径。

图2突出显示了增加物镜的数值孔径如何减小艾里斑的大小，从而增加可分辨细节的数量。

瑞利准则The Rayleigh Criterion

解决相邻的荧光团的问题是，随着艾里斑的移动距离越来越近，它们彼此融合而变得无法分辨（图3）。 因此，在1896年，瑞利勋爵（Lord Rayleigh）改进了阿贝（Abbe）方程，以考虑到两个荧光团之间的距离需要相差多远：

通过这种改进，区分具有高数值孔径（NA 1.4）物镜的两个GFP荧光团所需的距离为222 nm。

物镜分辨率极限

表1中的信息强调了使用GFP（510 nm）发射时，在各种不同的放大倍率和数值孔径下可能达到的分辨率极限。

请务必注意，物镜放大率对分辨率没有影响，数值孔径是唯一重要的值。 100x 1.40NA物镜具有与60x 1.40 NA物镜相同的分辨能力。同样，100x 1.30NA物镜具有与40x 1.30 NA物镜相同的分辨能力。

这就引出了一个明显的问题，如果40倍放大率达到相同的分辨率，为什么要使用100倍或60倍放大率呢？当使用更高的放大倍率物镜时，无缘无故地限制了视野。

通过使用较低的放大倍率物镜，从100倍1.30 NA的物镜变为40倍1.30 NA的物镜，视野增加了450％。这表示样品面积增加了450％，而分辨率没有损失。

同样，通过从60倍1.30 NA的物镜变为40倍1.30 NA的物镜，样品面积增加了200％。

那么为什么要使用更高的放大倍率物镜呢？这就是相机分辨率的用武之地。放大倍数在科学相机的分辨率中起着重要作用。

物镜数值孔径(NA)	分辨率极限（微米）
1x (0.04)	7.8
2x (0.06)	5.2
2x (0.10)	3.1
4x (0.10)	3.1
4x (0.12)	2.6
4x (0.20)	1.55
10x (0.25)	1.2
10x (0.30)	1.04
10x (0.45)	0.39
20x (0.40)	0.78
20x (0.50)	0.62
20x (0.75)	0.41
40x (0.65)	0.48
40x (0.95)	0.33
40x (1.00)	0.31
40x (1.30)	0.24
60x (0.80)	0.39
60x (0.95)	0.33
60x (1.40)	0.22
100x (0.90)	0.35
100x (1.25)	0.25
100x (1.30)	0.24
100x (1.40)	0.22

表1：使用不同能力的物镜和GFP（510 nm）发射的显微镜分辨率。 所有数字都假设一个完美对准和优化的光学系统。

相机的分辨率

相机分辨率的定义是相机传感器对图像进行采样的能力，科学相机的分辨能力完全取决于像素的大小及其放大倍数。 图4突出显示了如何通过物镜放大倍数来改变科学相机的像素大小。

使相机分辨率与显微镜分辨率匹配的最明显方法似乎就是简单地将表1中给出的衍射极限分辨率与单个像素的大小匹配。 然而，实际情况并非如此。 目标不仅仅是匹配显微镜的分辨率，而且要区分相邻的物体。

奈奎斯特采样

如图5所示，如果显微镜的分辨率与单个像素的大小匹配，则可能会将两个相邻的对象成像到相邻的像素上。在这种情况下，将无法将它们识别为结果图像中的两个单独的对象。

分离相邻特征需要存在至少一个具有不同强度值的中间像素。 因此，要获得最佳的空间分辨率，就需要将显微镜的衍射极限分辨率与传感器上的两个像素相匹配。 这称为奈奎斯特采样，可以使用以下公式计算：

匹配相机分辨率与显微镜分辨率

表2和3说明了在不同放大倍率下进行Nyquist采样所需的像素大小。这些表提供了以下问题的答案：如果40倍放大率达到相同的分辨率，为什么要使用100倍或60倍放大率？

如前所述，要实现Nyquist采样并使用GFP（510 nm）匹配显微镜分辨率，相机分辨率应达到0.22μm。 表2显示，对于40倍物镜，由于最终的相机分辨率为0.37μm，因此6.5μm像素太大。 6.5μm的像素被认为足以实现60倍的放大倍率，因为最终的相机分辨率达到0.25微米。

因此，需要较小的像素才能以40倍的分辨率实现奈奎斯特采样。 表3显示较小的像素尺寸4.25μm使相机在40倍放大倍率下分辨率达到了0.24μm，并且满足Nyquist采样定律。

物镜放大倍率	相机像素大 （微米）	有效像素大 （微米）	相机分辨率 （微米）	奈奎斯特采样 （510纳米）
10x	6.5	0.65	1.50	x
20x	6.5	0.33	0.75	x
40x	6.5	0.16	0.37	x
60x	6.5	0.11	0.25	✓
100x	6.5	0.07	0.15	✓

表2：6.5μm像素时物镜放大倍率对相机分辨率的影响，以及是否实现了奈奎斯特采样

物镜放大倍率	相机像素大 （微米）	有效像素大 （微米）	相机分辨率 （微米）	奈奎斯特采样 （510纳米）
10x	4.25	0.43	0.95	x
20x	4.25	0.21	0.49	x
40x	4.25	0.11	0.24	✓
60x	4.25	0.07	0.16	✓
100x	4.25	0.04	0.10	✓

表3：4.25μm像素时物镜放大倍率对相机分辨率的影响，以及是否实现了奈奎斯特采样

本节中显示的数据说明，可以使用的最低放大倍数受相机像素大小的限制，该像素大小必须足够小以匹配显微镜分辨率。

这就引出了一个新的问题：如果您的相机像素足够小，如果40倍的放大倍率可以达到相同的分辨率，为什么要使用100倍或60倍的倍率呢？

利用较小的像素获得更大的视野

典型的sCMOS相机以及背照式Prime BSI的像素尺寸为6.5μm，使其非常适合60倍物镜，但不太适合40倍物镜。同样，Prime 95B的像素设计为11μm大，非常适合100倍物镜。

但是，Iris 9和15型科学CMOS相机通过利用较小的4.25μm像素而设计用于具有较低放大倍率的高分辨率成像。这具有多个优点。

视野Field ofView

Iris相机的主要优点是能够降低放大倍率，从而在不牺牲分辨率的情况下增加了视野。

图6显示，在60倍的放大倍率，Iris 9和sCMOS相机可实现可比的图像质量和视野。使用该样品的显微镜分辨率为0.23μm，sCMOS相机与0.25μm的相机分辨率匹配，而Iris 9轻松与0.16μm的相机分辨率匹配。

但是，Iris 9的较小像素可以将放大倍率降低到40倍，并且仍然与奈奎斯特匹配。 图7显示，通过将放大倍率降低到40倍，显微镜分辨率（0.24μm）与Iris 9相机分辨率（0.24μm）完美匹配，而sCMOS相机在40x时的分辨率为0.37μm，对于奈奎斯特来说是1.5倍。 这意味着，对于这两个有相同分辨率的相机，Iris 9可以使用40倍放大率，而sCMOS必须使用60倍放大率。

显微镜分辨率在60x =0.23μm，Iris 9分辨率在60x = 0.16μm，sCMOS分辨率在60x = 0.25μm
显微镜分辨率在40x = 0.24μm，Iris 9分辨率在40x = 0.24μm，sCMOS分辨率在40x = 0.37μm

图8继续显示，在40倍的Iris 9和60倍的sCMOS之间，分辨率确实没有损失。 两款相机的有效像素大小相同，均为0.11μm，因此均达到了奈奎斯特（Nyquist）要求。唯一的区别是，Iris 9使用较低的放大倍率。

通过利用较小的像素，可以移至较低的放大倍率物镜来实现较大的视野。 从60倍放大到40倍放大，视野增加了150％，直接将数据吞吐量提高了150％，这是换到较小像素相机的巨大优势。

分辨率提高的实验分析

实验设计

为了演示较小像素相机在较低放大倍数下的分辨能力，进行了实验分析。生物样品的性质常常使它们对于精确的分辨率测量不可靠，因此，首选已知标准。为此，使用来自Argolight（http://argolight.com/products/argo-hm/）的Argo-HM幻灯片进行了实验。该幻灯片设计用于通过使用已知大小和荧光强度的稳定荧光图样来校准和监视荧光系统。

Argo-HM载玻片上的图案之一是专为量化分辨率而设计的（图9）。该图案由十三对具有不同中心间隙距离的线组成。这些“间隙对”从上到下排列，其中顶部间隙对之间的距离为100 nm，第十三间隙对之间的距离为700 nm。间隙对下降时，间隙对的分离距离增加50 nm。

图案由13对50μm长的线组成，中心线距离可变。 逐渐增加的间隙距离从100 nm（间隙对1）到700 nm（间隙对13）。
使用这张幻灯片，可以计算出相机可以准确分辨出的两条缝隙。

在Daybook（由Argolight设计的用于图像分析的软件）中分析数据。 上传原始数据，然后选择分析类型（横向分辨能力）。 该分析计算间隙对之间的间隔距离，显示哪些间隙对可以解析，哪些间隙对不能解析。 输出表显示计算出的间隔距离以及实际间隔距离以进行比较。 对比度平均值可用作确定间隙是否可以解析的置信区间。 Dawes准则（5％）或Rayleigh准则（26.3％）被视为所需的对比度值。 其中的一些数据如图10所示。

左上：单帧，逐渐间隔的间隙对的原始数据，并自动绘制ROI以进行分析。
右上：从ROI中的分辨率信息生成的图。 红色圆圈显示强度峰值，而蓝色圆圈显示在峰值之间是否检测到最小强度。 因此，蓝色圆圈表示检测到的间隙对的分离。在间隙对5中第一次 检测到分离。
右下：图形的数据值表。 峰值对索引对应于间隙对数。 计算的距离（μm）是相机检测到的分离距离，指定距离（μm）是预期的分离距离。 在间隙对5中第一次检测到分离，对应于0.3μm的分离距离。

Iris 9和sCMOS分辨率的Daybook分析

Iris 9（4.25μm像素）和82％sCMOS（6.5μm像素）连接到带有Cairn TwinCam 50/50图像分离器的显微镜（https://www.cairn research.co.uk/product/twincam/）同时获取两个相机的图像。 聚焦Argo-HM载玻片，检查并校正共焦度。 然后在两个相机上分别用60倍1.35 NA 的油浸物镜和40倍0.95 NA 的空气物镜获取图像进行比较。

进行比较时使用较低NA的 40x物镜，以复制实验室中已有的最常见的40x物镜。 也可应要求提供使用40x 1.30 NA物镜的数据。

60倍分析

之前在图10中显示了Iris 9数据，在图11中显示了sCMOS数据。

左上：单帧，逐渐间隔的间隙对的原始数据，并自动绘制ROI以进行分析。
右上：从ROI中的分辨率信息生成的图。在间隙对5中第一次 检测到分离。
右下：图形的数据值表。 在间隙对5中第一次 检测到分离，其对应于0.3μm的分离距离。

数据与上一节中讨论的一致，在60倍放大倍率下，两个相机都达到了Nyquist要求，因此具有相似的分辨能力。 两台相机都能检测到间隙对5中的300 nm间隔，这意味着两台相机都与显微镜分辨率相匹配，而显微镜分辨率仅受光的衍射极限的限制。

但是，当解析间隙对5中的分离时，Iris 9的确显示出了改进。图10中的数据显示，Iris 9检测到300 nm的分离，对比度平均值为1.98，而图11中的数据表明， sCMOS检测到300 nm的间隔，对比度平均值仅为0.44。 Iris 9在350 nm分离时满足了Dawes准则（5％），而sCMOS只在400 nm分离时才达到Dawes准则（误差范围内）。

40倍分析

左上：单帧，逐渐间隔的间隙对的原始数据，并自动绘制ROI进行分析。
右上：从ROI中的分辨率信息生成的图。 在间隙对7中第一次 检测到分离。
右下：图形的数据值表。 在间隙对7中第一次 检测到分离，其对应于0.4μm的分离距离。

左上：单帧，逐渐间隔的间隙对的原始数据，并自动绘制ROI进行分析。
右上：从ROI中的分辨率信息生成的图。 在间隙对9中第一次 检测到分离。
右下：图形的数据值表。 在间隙对9中第一次 检测到分离，其对应于0.5μm的分离距离。

图12和13中生成的结果与预期的结果一致。 在40倍时，Iris 9的4.25μm像素到达Nyquist，并且能够检测间隙对7中的400 nm间隔。然而，sCMOS的6.5μm像素无法到达Nyquist，只能检测间隙对9中500nm间距。在40倍放大倍率下，较大的6.5μm像素不具有分离任何其他间隙对所需的分辨能力。
Iris 9在间隙对11处（600nm）满足了Dawes准则（5％），而sCMOS仅在间隙对13处（700nm）才达到（误差范围内）。

综上所述，这些结果表明，使用较小像素的相机可以在较低的放大倍率下进行奈奎斯特采样。这意味着只要改变物镜放大倍率就可以实现更大的视野，从而获得更大的数据吞吐量。此外，使用具有更高放大倍率物镜的较小像素相机也没有缺点，这使其成为一种更加通用的选择。

较小的像素和较高的放大倍率

如上一节所述，使用较高放大倍率的物镜时，较小的像素相机性能同样出色。 通过过采样（使用小于Nyquist准则的像素大小），图像显得更平滑且具有更少的块状感（图14），这在创建用于发布的高质量图像时可能具有价值。 执行反卷积也使用过采样，这是一种重要的后处理工具，用于减少失焦光的影响。

结论

分辨率有两种： 显微镜分辨率和相机分辨率。 显微镜分辨率由物镜的数值孔径和发射光波长确定，而相机分辨率由像素大小确定。

在较低的（40x）放大倍率下可以达到衍射极限的分辨率，但是像素尺寸变得有限。 为了解决这个问题，像Iris 9和Iris 15这样的相机已经开发了较小的像素，以使研究人员可以将其移至较低的放大倍率物镜。 这具有在不牺牲分辨率的情况下增加视野的优点。 研究人员可以期望仅从60倍物镜转换为40倍即可提高200％的吞吐量。

另外，通过Iris相机我们现在能够提供能够以40倍，60倍和100倍实现奈奎斯特采样，以满足最具挑战性的样品的各种需求。

参考文献

Cairn Research – https://www.cairn-research.co.uk/
Argolight – http://argolight.com/

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