景深和聚焦深度Depth of Field and Depth of Focus

考虑光学显微镜的分辨率时，大部分重点放在垂直于光轴的平面中的点对点横向分辨率（图1）。分辨率的另一个重要方面是物镜的轴向（或纵向）分辨能力，该能力是平行于光轴测量的，通常被称为景深。

图1-景深范围

像水平分辨率一样，轴向分辨率仅由物镜的数值孔径决定（图2），目镜仅放大分解的细节并投影到中间像平面中。就像在经典摄影中一样，景深由从最近对焦的物体平面到同时对焦的最远平面的距离决定。在显微镜下，景深非常浅，通常以微米为单位进行测量。术语“聚焦深度”指的是图像空间，通常可以与“景深”（指的是物体空间）互换使用。

术语的这种互换会导致混淆，尤其是当这两个术语都专门用于表示显微镜物镜中的景深时。可以预期几何像平面代表样品的无限薄部分，但是即使在没有像差的情况下，每个像点也会散布成在该平面之上和之下延伸的衍射图。艾里斑是显微镜物镜产生的衍射图的基本单位，代表通过中间像平面中心的截面。这会增加通过稍微不同的样本平面的Z轴艾里斑强度分布的有效聚焦深度。

表1-景深和影像深度

聚焦深度随数值孔径和物镜的放大倍数而变化，并且在某些情况下，即使景深较小，高数值孔径系统（通常具有较高的放大倍率）也比低数值孔径的系统具有更高的聚焦深度。 （请参阅表1）。这在显微摄影中尤为重要，因为胶片乳剂或数码相机传感器必须落在聚焦区域内的平面上曝光或照明。在高放大倍率下对焦出现的微小错误并不像具有非常低的放大倍率的物镜对焦错误那样关键。表1列出了随着数值孔径和放大率的增加，一系列物镜在中间像平面中景深和像深的计算变化。

在显微镜的高数值孔径下，景深主要由波动光学系统决定，而在较低的数值孔径下，几何光学弥散圈占主导地位。使用多种不同的准则来确定图像何时变得不可接受的清晰，几位作者提出了不同的公式来描述显微镜中的景深。总的景深由波动和几何光学景深之和得出：

其中d_tot代表景深，λ是照明光的波长，n是盖玻片和物镜前透镜之间的介质（通常是空气（1.000）或浸油（1.515））的折射率，NA是物镜数值孔径。变量e是放置在显微镜物镜像面上的检测器可分辨的最小距离，其横向放大倍数为M。使用该方程式，景深（d_tot）和波长（λ）必须以相似单位表示。例如，如果要以微米为单位计算d_tot，则λ也必须以微米为单位（将700纳米的红光作为0.7微米输入方程式中）。请注意，衍射极限景深（方程式中的第一项）与数值孔径的平方成反比，而分辨率的横向极限则以与数值孔径的一阶成反比的方式减小。因此，与显微镜的横向分辨率相比，可获得的光学轴向分辨率和厚度受系统数值孔径的影响要大得多。

人眼通常可以适应从无限远到约25厘米的距离，因此，当人们通过目镜观察显微镜图像时，景深可以大大大于以上等式给出的景深。另一方面，图像传感器或照相乳剂位于较薄的固定平面中，因此方程式中的参数给出了使用这些传感器的景深和轴向分辨率。按照惯例，轴向分辨率定义为沿物镜产生的三维衍射图像的轴，在焦点上方和下方的第一个最小值之间的距离的四分之一。

图2-景深与数值孔径的关系

这些景深值以及三维衍射图样中的强度分布，是针对聚光镜的数值孔径大于或等于物镜的数值孔径的非相干照明（或发射）点光源计算的。通常，随着照明相干性的增加（当聚光镜数值孔径接近零时），景深会增加至2倍。但是，具有部分相干照明的三维点扩散函数（PSF）可能会以复杂的方式偏离到目前为止讨论的孔径函数不均匀的情况。在许多基于相位产生对比度的显微模式中，景深可能出乎意料地比根据上述等式预测的要浅，并且可能会产生极薄的光学截面。

在数字和视频显微镜中，摄像机管或CCD目标的浅焦平面，在高物镜和聚光镜数值孔径下可实现的高对比度以及监视器上显示的图像的高放大倍率均有助于减小景深。因此，通过视频，我们可以获得非常清晰锐利的光学截面，并且可以非常高精度地定义薄样品的焦距。

撰稿人
Kenneth R. Spring – Scientific Consultant, Lusby, Maryland, 20657.
Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.