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常见问题

如何测试科学相机的成像性能？

常见问题, 成像技术

介绍

探测器是任何显微镜系统中最重要的组件之一。 准确的探测器读数对于收集可靠的生物学数据进行发表和处理至关重要。

为了确保您的相机性能正常，Photometrics设计了一系列可以在任何显微镜上进行的测试。这些测试的结果将为您提供有关当前相机状态的可量化信息，并提供一种方法。 比较相机，如果您正在决定购买新相机，这可能会很有价值。

本文将首先指导您如何将测量的信号转换为检测到的电子的实际数量，然后使用这些电子数量进行测试。 本文档中的测试均使用ImageJ和Micro-Manager软件，因为它们均功能强大且免费提供。

第1部分 使用光电子

测量光电子

背景

当入射到探测器上的光子转换成电子时，就会检测到荧光信号。正是这种电子信号被相机中的模数转换器（ADC）转换为计算机报告的灰度（ADU）。

尽管灰度级与信号强度成正比，但并不是每个相机都将电子转换为相同数量的灰度级，这使得灰度级无法用于发表的量化信号。

相反，应该在光电子中对信号进行量化，因为这些是强度测量的真实值，可以在所有相机中实现一致的信号表示。然后可以将该信号与噪声进行比较，以通过信噪比评估图像质量。

方法

要将灰度级信号转换为电子信号：

  1. 将图像加载到ImageJ中，选择一个荧光点并在其上画一条线。
  2. 从“Analyse”菜单中选择“Plot Profile”（图1），获得一个以灰度级表示的波形，峰值表示信号。峰的顶部是信号值。
如何测试科学相机的成像性能？
图1
  1. 从此灰度信号中减去相机的偏置。
  2. 将结果乘以相机系统的增益。

完整的等式是：电子信号=（灰度信号-偏置）x增益

相机偏置和相机系统增益可以在相机的性能证书（COP）或随相机提供的其他信息上找到，或者可以通过以下说明的测试来计算它们。
例如，上图中的数据是使用Prime 95B™拍摄的，该产品的偏置约为100，增益约为1.18。 通过将这些值带入方程式，我们得到以下结果：

电子信号=（1791-100）x 1.18
信号=  1995 e-

测量相机偏置

背景

当可视化荧光图像时，我们期望像素的强度值仅对应于样品中的荧光强度。 但是，每个照相机都有一个背景偏移，即使在没有光线的情况下，该偏移也会为每个像素提供非零值。 我们称其为相机偏置。

偏置值是抵消波动的读出噪声值所必需的，否则波动值可能会低于零。 因此，偏置值应大于零且在所有像素上均相等。 偏置值不包含任何检测到的信号，因此在尝试计算光电子中的信号之前，必须从图像中减去它。

方法

要计算相机偏差：

  1. 将相机设置为零毫秒曝光时间。
  2. 装上镜头盖或关闭相机光圈防止光线进入相机。
  3. 使用这些设置拍摄100帧（图2）。
如何测试科学相机的成像性能？
图2
  1. 从“Image”菜单中选择“Stacks”，然后单击“Plot Z-axis Profile” （图3），计算每帧的平均值。 这应该为您在 “Results”窗口中提供每一帧的平均值。
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图3
  1. 在Results菜单中选择Summarize来汇总计算100帧平均值的平均值（图4）。
如何测试科学相机的成像性能？
图4

偏置是一帧的平均值，因此通过绘制所有100帧的平均值，我们可以计算出更准确的相机偏置。

计算相机增益

背景

当进入相机的光量线性增加时，相机的灰度响应也应线性增加。

增益表示入射到检测器上的光经过处理和量化后的量化过程。根据电子和个别属性的不同，相机之间的增益也有差异，但是可以通过实验来计算。如果进行多次测量并相互绘制，则直线的斜率应代表增益的线性度。

方法

相机系统增益是通过单点平均方差测试计算的，该测试计算进入相机的光与相机对其的响应之间的线性关系。要执行此测试：

  1. 如上一节所述，用相机拍摄一个100帧的偏置堆栈并计算平均偏差。
  2. 使用5ms的曝光时间，在相同的光照水平下拍摄2张图像。
  3. 在ImageJ中，测量两个图像的均值并将其平均。我们称之为MeanImage1,Image2（图5）。
如何测试科学相机的成像性能？
图5
  1. 从“Analyze”菜单中选择“Image Calculator”来计算两个图像之间的差异。 选择两个帧并相减，您将需要浮动结果。 按OK生成差异图像（图6）。
如何测试科学相机的成像性能？
图6
  1. 测量差异图像的标准偏差，我们将其称为标准偏差差异图像（图7）。
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图7
  1. 使用以下公式计算两个图像的方差：
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  1. 使用以下公式从方差计算增益，切记删除先前计算的偏差：
如何测试科学相机的成像性能？

增益表示为e– /灰度水平。

  1. 以10ms，20ms和40ms的曝光时间重复此过程，以检查在不同的光照水平下增益是否一致。

计算信噪比（SNR）

背景

信噪比以像素为单位描述了测量信号与该信号不确定性之间的关系。 它实质上是像素上测得的信号与整体测得的噪声之比。 大多数显微镜应用程序都希望最大化信号并最小化噪声。

所有相机都会产生电子噪声，其主要来源是读出噪声，光子散粒噪声和暗电流。 这些噪声值显示在相机数据表上，并且始终以电子显示。 这意味着，计算信噪比的最准确方法是将电子信号与电子噪声进行比较。

方法

可以使用以下公式计算信噪比：

如何测试科学相机的成像性能？

这里：

S =信号，以电子数表示
计算方程中使用的电子信号的最佳方法是如本文档开头所述，在高荧光区域画一条线。
Nd =暗电流，电子/像素/秒
Nr =读出噪声，以电子数表示
t =曝光时间，以秒为单位

第2部分 测试相机质量

评估偏置质量

背景

在偏置中有两点要注意，稳定性和固定模式噪声。

稳定性只是偏差随时间偏离其设定值多少的一个因素。波动较大的偏差将不会提供可靠的强度值。

固定模式噪声通常在具有较长曝光时间的背景中可见，并且当特定像素的亮度高于背景噪声时会发生。由于像素始终相同，因此可以在背景中看到明显的图案。这会影响像素强度的准确报告，还会影响要发布的图像的美学质量。

方法

要评估偏置稳定性：

  1. 绘制上一节中获取的所有100个偏置帧的平均值。
  2. 拟合直线并观察线性度。

Teledyne Photometrics的目标是产生一个稳定的偏置，该偏置不会偏离一个以上的电子，这里使用的Prime 95B™科学CMOS相机数据显示如（图8）。

如何测试科学相机的成像性能？
图8

要评估固定模式噪声：

  1. 将明亮的样品安装在显微镜上，并用高亮度照明
  2. 将曝光时间设置为100毫秒
  3. 捕捉图像
  4. 如有必要，以更长的曝光时间重复此实验

如Prime 95B的图9中所示的“干净”偏差将提供更准确的强度数据并产生更高质量的图像。

如何测试科学相机的成像性能？
图9

评估增益质量

背景

增益线性度非常重要，因为增益直接影响电子信号如何转换为计算机读取的数字信号。 与直线的任何偏离都表示数字化不准确。

方法

要评估增益线性度：

  1. 根据“计算相机增益“部分中收集的数据绘制MeanImage1 – Image2 – VarianceImage1 – Image2图
  2. 拟合直线并观察线性度

Teledyne Photometrics建议任何偏离直线的偏差不超过1％，如图10所示用CoolSNAP™DYNO生成的数据：

如何测试科学相机的成像性能？
图10

计算读出噪声

背景

读出噪声存在于所有相机中，并将对信噪比产生负面影响。 它是由电子转换为解释计算机上图像所需的数字值引起的。 该过程本质上是嘈杂的，但相机电子电路的质量可以减轻这种干扰。 优质的相机会大大减少噪点。

读出噪声将在相机的规格书，性能证书或相机随附的其他信息中说明。 也可以按照以下说明进行计算。

方法

读出噪声可以通过以下方法计算：

  1. 用相机拍摄两张偏置图像
  2. 在ImageJ中，从“Analyze”菜单中选择“Image Caculator”来计算两个图像之间的差异。 选择两个帧和“Difference”，您将需要浮动结果。 按OK生成差异图像（图11）。
如何测试科学相机的成像性能？
图11
  1. 测量差异图像的标准偏差，我们将其称为标准偏差差异图像（图12）。
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图12
  1. 使用以下等式计算系统读出噪声，您需要先前计算出的增益值，或者可以使用相机随附信息中提供的增益值：
如何测试科学相机的成像性能？

计算暗电流

背景

暗电流是由热产生的电子引起的，即使在没有曝光的情况下，这些电子也会在像素上堆积。如果时间足够长，暗电流将累积直到每个像素被填充。通常，像素将在采集之前被清除，但暗电流仍会累积，直到再次清除像素为止。为解决此问题，通过冷却相机可大大减少暗电流。您可以使用以下方法计算暗电流在相机上累积的速度。

方法

要计算在不同的曝光时间下累积了多少暗电流，您需要创建一个暗帧。暗帧是指在黑暗中或快门关闭时拍摄的帧。通过创建具有不同曝光时间或采集时间的多个暗帧，可以允许或多或少的暗电流积累。

为此应执行：

  1. 避免任何光线进入相机，并在您感兴趣的曝光时间或采集时间拍摄图像。例如，您可能使用10毫秒的曝光时间，但如果您打算连续拍摄30秒。在这种情况下，您应该准备一个30秒的暗帧。
  2. 每个时间条件拍摄两个暗帧。
  3. 在ImageJ中，从“Analyze”菜单中选择“Image Calculator”来计算两个暗帧之间的差异。选择两个帧和“Difference”，您将需要浮动结果。按确定以生成差异图像。
  4. 测量差异图像的标准偏差，我们将其称为标准偏差差异图像deviationDiff image。
  5. 使用以下公式计算系统读出噪声和暗电流：
如何测试科学相机的成像性能？

注意-公式与上一节相同，但是由于我们允许相机曝光一定的时间，因此，在读出噪声的基础上，暗电流已经形成。

  1. 减去由上一节中计算得出的读出噪声所贡献的电子数，剩下由暗电流所产生的噪声。
  2. 将计算出的暗电流值与采集时间进行比较，以确定每单位时间累积多少暗电流。
  3. 可以在不同的曝光时间和温度下重复此实验，以确定冷却对暗电流累积的影响。

计数热像素

背景

热像素是看起来比应该看起来明亮的像素。 它们是由电荷泄漏到传感器阱中引起的，这会增加阱中的电压。 它们是暗电流的一个方面，因此电荷会随时间累积，但无法与其他形式的暗电流分开。

方法

要识别热像素：

  1. 使用相机拍摄偏置帧。
  2. 防止任何光线进入相机，用长时间（〜5秒）曝光，拍摄10帧图像形成一个堆栈。
  3. 在ImageJ中，通过从“Analyze”菜单中选择“Image Calculator”，从长时间曝光帧之一中减去偏置帧。 选择两个框架并相减，您将需要浮动结果。 按OK生成图像（图13）。
如何测试科学相机的成像性能？
图13
  1. 热像素应立即在深色背景上显示为亮白色斑点。 在各个热像素上绘制线条轮廓以测量强度（图14）。
如何测试科学相机的成像性能？
图14
  1. 比较所有10个长时间曝光帧之间的热像素。

热像素的优势在于它们始终位于同一位置，因此一旦被识别，在数据处理时这些像素就可以忽略不计。

像正常的暗电流一样，相机冷却可以大大减少热像素数量。 如果仍然存在热像素问题，则可以调整相机的风扇速度以提供更好的冷却效果，甚至切换到液冷系统—针对制冷相机。

以上内容原文摘自https://www.photometrics.com ，由子健电子（上海）有限公司翻译整理， 转载请注明。

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